Reglering av fotoperiodisk blomning hos Arabidopsis med hjälp av fotoreceptorer

Regulation of photoperiodic flowering by Arabidopsis photoreceptors,

T. Mockler, H. Yang, XuHong Yu, D. Parikh, Ying-chia Cheng, S. Dolan, and C. Lin, 2002

Sammanfattning av Ingvor Zetterlund

Inledning

Fotoperiodism är dagslängdsberoende säsongförändringar hos växter i deras fysiologisk eller utveck­lingsaktivitet. Fotoperiodisk blomning hos växter regleras m h a fotosensoriska receptorer, bl a röd/långvågsröd ljusreceptor fytokrom och blå/UV ljusreceptor kryptokrom. Fotoreceptorernas moleky­lära mekanismer är fortfarande otillräckligt utforskade. I det här arbetet genomfördes studier av dags­längdsberoende respons hos kryptokrom 2 (cry2) och fytokrom A (phyA) och deras roll som dags­längdssensorer. Mängder av proteiner cry2 och phyA visade en dygnrytm hos växter, som växte under kortdags förhållanden, dock inte hos växter, som växte under långdags förhållanden. Den kortdags speci­fika dygnsrytmen hos cry2 är först fastställd genom blåljusberoende omsättning av cry2. Med utgångs­punkt att cry2 och phyA är de viktigaste dagslängdssensorer i Arabidopsis, visar förskare i det här experimentet att phyA inducerar blomning i långvågsröd ljus med verkan, som liknar den hos cry2. En modell, baserad på de här resultaten och på iakttagelse att fotoperiodisk respons hos växter beror på ljuskvalité, var föreslagen för att förklara hur fytokrom och kryptokrom interagerar med varandra för att skapa fotoperiodisk respons hos Arabidopsis.

 

Fotoperiodisk blomning var det första dokumenterade fotoperiodiska fenomenet hos växter. Blomningen hos långdags- (LD) eller kortdagsväxter (SD) inträffar eller ökar under långdags- respektive kortdagsförhållanden. Arabidopsis är fakultativt LD växt, och regleringen av dess blomningstid var intensivt studerad. Detalje­rad mekanism, som är grundläggande för fotoperiodism, är inte väll förstådd, men omfattande fysiolo­giska studier av växter stödjer en hypotes, som hänvisar till en modell av extern coincidence. Enligt hy­potesen måste ljussignal interagera med fotoperiodisk rytmisk respons (PRR) av cellulär aktivitet under lämplig dagtid. mRNA uttryck av blomningstidsgener i Arabidopsis, bl a CO, GI och FT, visade att cir­kadiansk rytm hos plantor, som växte under LD och SD förhållanden, var av olika slag. Det dagslängds­beroende cirkadianska uttrycket av en eller fler blomningstidsgener kan utgöra exempel på PRR.

 

Arabidopsis har nio fotosensoriska receptorer: fem fytokromer (phyA – phyE), två kryptokromer (cry1 och cry2) och två fototropiner (phot1 och phot2) för att reglera de flesta av sina ljusresponser. Fytokrom och kryptokrom är kända som reglerare av blomningstid och mängder av proteiner phyA och cry2 regle­ras m h a ljus. De här studierna visar att cry2 och phyA kan fungera som betydande dagslängdsreceptorer. Coincidence av ljusperception genom cry2 och phyA med höjdpunkten av cirkadianska uttrycket av CO-genen är kritisk för inducering av FT- blomningstidsgen uttryck och fotoperiodisk blomning.

 

Cry2 och phyA var utforskade för att förstå skillnader i deras fotoperiodiska respons samt den mekanism som ligger bakom Arabidopsis fotoperiodiska blomning.

Växtmaterial

Flera ekotyper av vild typ wt Arabidopsis användes i experimentet. Mångfald fotoreceptoriska mutanter var förberedda m h a genetiska screens eller korsningar. Inblandade alleler hos mutanter var: cry2-1, cry1-304, hy-B104, phyB-9 och phyA-211. Dubbelmutant cry2-1/phyA-403 och trippelmutant cry2-1 cry1-304 phyA-412 var isolerade från etyl methanesulfonate-mutagenized cry2-1 eller fast-neutron mutagenized cry2-1/cry1-304 dubbelmutants frön, respektive och backkorsade två gånger med vild typ (Col-4). Blomningstid och längden på hypokotyl blev mätande och beskrivna. ”Dagar till blomning” var de dagar mellan det datum då plantor var placerade under ljus, tills det datum, då de första blomknoppar kom upp.

Ljuskällor och spektrala mått, dimensioner

Plantor var belysta med fluorescent kallt vitt ljus (om annat inte anges). Användes följande lampor:

Ljusspektra och flödeshastighet mättes m h a LI-1800 spektroradiometer. Våglängder för genomsläppan­de toppar för filtrerande blå, röd och FR ljus var 449, 660 och 750 nm respektive.

Den fotoperiodiskt beroende oscillationen av cry2 och phyA

Bland de fem fytokromer och två kryptokromer i Arabidopsis är phyA och cry2 de enda fotoreceptorer, vars proteinnivåer regleras genom ljusinducerad proteolys. Mängden av cry2 och phyA visar en daglig oscillation hos plantor, som växer i SD. Mängden av de fotoreceptorerna minskar under dag och ökar under natt. Liten mängd av dags väx­lande cry2 och phyA proteiner var observerad i plantor, som växte i LD förhållanden. Mängden av cry1 protein, som till syntes inte är reglerat av ljus, visar liten oscillation under båda SD och LD. Slutsatsen är att mängder av proteiner cry2 och phyA ändras vid olika tidpunkter på dagen och att daglig oscillation av cry2 och phyA beror på dags längden.

cry2 oscillation är beroende av blått ljus

Under förutsättning att cry2 och phyA är försvagade i lju­set, kan man förvänta att den dagliga oscillationen av de två fotoreceptorerna fungerar snarare som en ljusberoende dygnrytm, än en cirkadiansk rytm, som är kontrollerad av den cirkadianska klockan. Vis­serligen den observerade cry2- och phyA-oscillation hos plantor, som växte i SD, förminskades dras­tiskt, när plantor var omplacerade från SD till kontinuerligt ljus, alltså mängd av cry2 kontinuerligt ökade i subjektiv natt under det konstanta ljusförhållandet. För att förstå bättre den rollen av ljus och cir­kadiansk rytm i regleringen av proteins cry2 oscillation, testade man hur olika ljusvåglängder kan på­verka cry2-uttryck. Arabidopsis plantor, som växte periodvisst i 12 timmar blåljus/12 timmar mörker (12 hBL/12 hD), var omplacerade till antingen kontinuerligt rött ljus eller kontinuerligt blåljus, och cry2-protein var analyserat före och efter omplaceringen. cry2-nivåer visade en klar dygnsrytm hos de plan­tor som växte i 12 hBL/12 hD förhållanden, men inte hos de plantor som växte i 12 timmar vitt ljus/12 timmar mörker eller 12 timmar rött ljus/12 timmar mörker. Den rytmiska förändringen av cry2-mängd, som var funnen i 12 hBL/12 hD försvann helt, när plantor var omplacerade till kontinuerligt rött ljus.

Figur 1

Oscillationen av mängder cry2-proteinet försvann också nästan helt i kontinuerligt blått ljus, fastän en liten ökning av cry2-mängden på subjektiva natten var urskiljbar. cry2-protein nivåer förblev alltid höga i plantor, som var omplacerade till kontinuerligt rött ljus (Figur 1A) eller alltid låga i plantor, som var omplacerade till kontinuerligt blåljus. De här resultaten har bekräftat att dygnrytmen hos cry2 beror på blåljus.

De ovannämnda observationerna leder till slutsatsen, att dygnrytmen av cry2-oscillation i SD bestäms av blåljusberoende cry2-nedgång.

Cirkadiansk rytm och den dagliga cry2-oscillationen

Som det var påpekat ovan, fortsatte cry2 mängder i plantor, som var omplacerade från SD eller 12 hBL/12 hD till konstant ljus, att öka lite på den subjektiva natten. Dessutom steg cry2 nivån i plantor, som växte under 12 hBL/12 hD perioder, innan den subjektiva natten. Under 12 hBL/12 hD period ökade nivån av cry2-proteinet långsamt under den ljusa fasen, vilket är överensstämmande med det förväntade fenomenet, som ofta är associerat med cir­kadianska rytmen. Den här observationen är förenlig med cirkadianska rytmens roll i regleringen av cry2. Den här förväntan känns specifik för blåljus, därför att detta inte var funnet i plantor, som växte i 12 timmar rött ljus/12 timmars mörker eller 9 timmar vitt ljus/15 timmar mörker. Den här observationen känns bevisa att cirkadiansk rytm kanske inte är direkt relaterad till cry2-oscillation, p g a att cirkadiansk rytm fungerar i båda blått och rött ljus. Det är möjligt att cry2 kan åstadkomma blåljusreglering av en specifik output pathway, som kontrollerar CRY2 mRNA uttryck. Omväxlande kan finnas cry2-omsätt­ning feedback reglering, och fytokromer kan undertrycka den feedback regleringen.

phyA främjar blomningen i FR ljus

Det har varit undersökt hur phyA främ­jar blomning i FR ljus, p g a att phyA är känd för inhibering av hypokotyls elongering i FR. Plantor groddes i näringsrikt medium under belysning med kontinuerligt FR ljus, och blomningstid hos olika fe­notyper jämfördes. P g a att fotosyntetiska pigment absorberar huvudsakligen rött och blått ljus, stödjer FR ljus inte fotosyntesen. Arabidopsis plantor, som växte på näringsrikt medium, kunde blomma i mörker, och följaktligen i FR ljus. Verkligen började vild typ, cry2- och phyB-mutanter blomma cirka 20 dagar efter planteringen. Däremot phyA-mutant och dubbelmutanter, som hade phyA skada, blommade inte under de här förhållandena på 46 dagar tills experimentet blev avslutat.

 

Det faktum att phyA mutanten inte har blommat i FR ljus, kan leda till slutsatsen att induktion av blom­ningen i FR sker m h a phyA. Som resulta­tet av phyA-mutationen kunde plantorna erhålla ett grundläggande utvecklings defekt. Eftersom blomsterbörjan är bestämd på groddplantas tidiga stadium, är det möjligt att brist i phyA-beroende processen hos groddplantan påverkar båda blomningstids kontroll och andra utvecklingsprocesser. Man analyserade blomningstid för plantor, som växte i blandad jord under rött + FR (R + FR) ljus, som stödjer fotosyntes. phyA-mutanter blommade betydligt senare (> 40 dagar) än vild typ (ca 26 dagar) i R + FR ljus förhållandet, däremot i kontinuerligt rött ljus blommade phyA bara lite senare än wt. Det resultatet stödjer hypotesen att phyA främjar blomning i FR ljus. Eftersom phyA-mutant inte kunde blomma i FR var det bevisat att phyA kunde fungera oberoende av andra fotoreceptorer.

 

Fytokromer är fotointerkonvertibla molekyler, som interkonverteras mellan FR-absorberande Pfr och R-absorberande fytokrom (Pr). Pfr är vanligen tänkbart den fysiologiskt aktiva formen, då däremot Pr är den inaktiva formen. Den här interpreteringen inför en svårighet i förklaring hur phyA kan åstadkomma en FR respons hos ljust växande mogna plantor, där phyA-mängd är betydligt lägre, än den i etiolerade plantor. Emellertid var det nyligen rapporterat, att den aktiva formen av phyA kan vara varken Pfr eller Pr. Istället kan en kort levande intermediär, genererat under fotokonversion från Pfr till Pr, vara den ak­tiva formen.

cry1, cry2 och phyA fungerar friställt för att inducera blomning i blåljus

Till skill­nad från andra fytokromer har phyA blivit känt för inhibering av hypo­kotyls elongering i blåljus. För att testa om phyA kan reglera blomningstid jämförde man blomningstider hos phyA-mutanter och kryptokroms mutanter, som växte i kontinuerligt blåljus. De monogena cry1-, cry2- eller phyA-mutanter blommade i ungefär samma tid som wt; dubbelmutant skadad i någon av de tre fo­toreceptorerna eller cry1cry2phyA-trippelmutant blommade betydligt senare. Det här resultatet indikerar att de tre fotoreceptorerna fungerar friställt i främjande av blomning i blåljus.

 

Tre fotoreceptorers pathways reglerar blomningstid hos Arabidopsis

Det finns tre huvudsakliga fotoreceptorers pathways hos Arabidopsis: R, B och FR, som uppfångar röda, blåa eller FR regioner av solljusets spektrum, för att reglera blomningstid. R pathway (se Figur 2) är reglerad av phyB, som agerar på överlappande sätt med phyD och phyE, för att inhibera blomning i rött ljus. B pathway är åstadkommen huvudsakligen av kryptokromer, men även av phyA. I B pathway spelar cry2 betydande roll i undertryck av R pathway i blåljus, medan cry1, cry2 och phyA agerar friställt i främjande av blomning. FR pathway är reglerad av phyA, vilket agerar på två sätt, inhibering av R pathway och inducering av blomning i FR ljus.

Figur 2

 

Enligt modellen i Figur 2A är B och FR pathways funktionellt redundanta i naturligt ljus, som är rikt i både blått och FR spektrum. Sådant funktionellt överflöd kan förklara en gåtfull observation av cry2 mutant. Det var sagt att cry2-mutant blommade betydligt senare än wt under uppväxt i fluorescent kalt vitt ljus (CW), vilket innehåller lite FR. Men när cry2-mutant växte i ljus rikt på FR, blommade den vid ca samma tidpunkt som wt. En förklaring för den här avvikelsen är att cry2 funktion beror på den aktiva formen av fytokrom (Pft), som minskar i plantor som växer i ljus rikt på FR. En alternativ interpretering är att FR pathway, som phyA åstadkommer, är funktionellt övertalig med B pathway som huvudsakligen åstadkoms av cry2. Följaktligen när cry2 mutanter växer i ljuset rikt på FR, är FR pathway tillräckligt kraftig, för att kompensera den försvagade B pathway. Blomningstiden hos plantor, som växte under förhållandet CW+FR ljus, sammanställdes. Inga monogeniska fotoreceptorsmutanter visade någon be­tydlig blomningstids förändring under det här ljusförhållandet. Mutationer i två av de tre fotoreceptors gener inklusive CRY1, CRY2 och PHYA, har resulterat i svag försening av blomning. Vad som är be­tecknande cry1cry2phyA-trippelmutant visade den mest dramatiska förseningen av blomning: det tog ungefär dubbelt så lång tid för att börja blomma än för wt, som växte under förhållandet CW+FR ljus. Det här resultatet är överensstämmande med den uppfattning att cry2-beroende B pathway och phyA-be­roende FR pathway agerar överskjutande på ett liknande sätt för att främja blominförande.

 

Den föreslagna modifierade extern coincidence modell förklarar hur fotoreceptorerna reglerar fotoperiodisk blom­ning. I enlighet med den modellen kan signaltransduktionen av B och FR pathways främja blomningen när de sammanfaller med den sensitiva fasen av PRR. För en LD planta som Arabidopsis, är mer sannolikt att inträffa coincidence av B och FR pathways och den sensitiva fasen av PRR i LD, än i SD; följaktligen blommar LD plantor tidigare i LD än i SD. Den hypotesen verkar förklara inte bara resulta­ten av genetiska studier av fotoreceptors mutanter genomförda i kontinuerligt ljus, men också den ef­fekten av ljuskvalitet på fotoperiodisk respons och Arabidopsis fotoperiodisk blomning.

Arabidopsis fotoperiodiska känslighet beror på ljusets kvalitet

Den modell, som är föreslagen i Figur 2A, verkar förklara det mesta om förändringar i fenotypen, som är observerade i fotoreceptor-mutanter, analyserande i olika variationer av ljusförhållandet. För att ytterligare förstå fotoreceptors kontroll av fotoperiodism, har man analyserat hur ljuskvalitet påverkar fotoperiodisk blomning hos Arabidopsis. Blomningstid av tre av de mest använda Arabidopsis accessioner (Col, Ler, WS), som vuxit i LD eller SD belysta med ljus med specifika våglängder jämfördes. Alla Arabidopsis accessioner visar den minsta fotoperiodiska känsligheten i rött ljus: skillnaden i blomningstid mellan SD och LD är den minsta under rött ljus belysning. Däremot plantor, som växte i blåljus, var mycket känsliga mot fotoperioder. För att förklara fotoperiodisk känslighets beroende av ljuskvalitet, ges en ny tolkning åt tre fotoreceptors signa­lering pathways i kontexten av den ”extern coincidence” hypotesen. I enlighet med den nya modellen regleras signaltransduktion av B och FR pathways genom PRR. B och FR pathways främjar blomnings initiering bara när de överensstämmer med den sensitiva fasen av PRR. Effekten av B och FR pathways på blomnings initiering förminskas i de okänsliga faserna av PRR. I frånvaro av blåljus och FR ljus ingen av B eller FR pathways är aktiva, så plantor växande i rött ljus är okänsliga mot fotoperioder, och de blommar ungefär samma tid i LD och SD. I frånvaro av R pathway är B och FR pathways fortfarande reglerande av PRR, som är kontrollerad av cirkadiansk rytm. Dessutom cry2 och phyA, som är de vikti­gaste fotoreceptorer som medlar B och FR pathways respektive, kan urskilja dagslängden genom föränd­ring av deras mönsteruttryck. Följaktligen plantor växande i fotoperioder belysta med blåljus (eller vil­ken som helt spektrum, som är tolerant till B eller FR pathways) är fortfarande sensitiva mot fotoperio­der. Rött ljus, som användes i experimentet, vars längd i utstrålande spektrum spreds bortom 700 nm, kan innehålla överbliven FR. Detta kan förklara varför överbliven fotoperiodisk känslighet finns i plan­tor växande i R fotoperioder, och varför plantor växande i B+R fotoperioder visade fotoperiods känslig­het liknande med den, som hos plantor växande i B+FR.